對(duì)于廣西無菌檢驗(yàn)員培訓(xùn)學(xué)員來說，微生物限度檢查方法適用性驗(yàn)證是繞不開的課題，亦是檢驗(yàn)員應(yīng)知應(yīng)會(huì)事項(xiàng)，本文為大家介紹微生物限度檢查方法適用性驗(yàn)證實(shí)操流程，一起看正文。
廣西無菌檢驗(yàn)員培訓(xùn)知識(shí)之微生物限度檢查方法適用性驗(yàn)證實(shí)操流程
1.試驗(yàn)準(zhǔn)備
（1）試驗(yàn)菌株（傳代≤5 代，從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第 0 代）：
計(jì)數(shù)法驗(yàn)證：金黃色葡萄球菌（CMCC (B) 26003）、大腸埃希菌（CMCC (B) 44102）、白色念珠菌（CMCC (F) 98001）、黑曲霉（CMCC (F) 98003）；
控制菌驗(yàn)證：按樣品標(biāo)準(zhǔn)要求選擇（如口服制劑選大腸埃希菌，外用藥選金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）；
（2）培養(yǎng)基與試劑：胰酪大豆胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基等，需提前做適用性檢查（促生長(zhǎng)能力、抑制能力、指示特性達(dá)標(biāo)）；
（3）儀器設(shè)備：生物安全柜（ISO5 級(jí)潔凈環(huán)境）、恒溫培養(yǎng)箱（精度 ±0.5℃）、薄膜過濾系統(tǒng)（濾膜孔徑 0.45μm）、高壓蒸汽滅菌器等，需經(jīng)校準(zhǔn)合格。
2.樣品前處理（關(guān)鍵防干擾步驟）
（1）普通樣品：
固體樣品（片劑、中藥材）：稱取 10g 加 90mL pH7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液，均質(zhì)制成 1:10 稀釋液；
液體樣品（口服液）：取 10mL 加 90mL 稀釋液，制成 1:10 稀釋液；
膏狀樣品（軟膏）：取 10g 加含無菌吐溫 80 的稀釋液，40-45℃水浴分散后制成 1:10 稀釋液；
（2）抑菌性樣品（含防腐劑、抗生素等）：
稀釋法：加大稀釋倍數(shù)（如 1:1000）降低抑菌濃度；
中和法：針對(duì)性加入中和劑（青霉素酶中和青霉素，硫代硫酸鈉中和含氯成分）；
薄膜過濾法：過濾后用 300-500mL 沖洗液分 3-5 次沖洗濾膜，去除殘留抑菌成分。
3. 計(jì)數(shù)法驗(yàn)證操作
（1）菌液制備：將細(xì)菌接種于胰酪大豆胨培養(yǎng)基，30-35℃培養(yǎng) 18-24h；真菌接種于沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，20-25℃培養(yǎng) 2-3 天，用稀釋液制成 10-100CFU/mL 的菌懸液（室溫 2h 內(nèi)使用，2-8℃可保存 24h）；
（2）試驗(yàn)組：取 1mL 供試品稀釋液 + 0.1mL 菌懸液，注入平皿或經(jīng)薄膜過濾后接種培養(yǎng)基；
（3）對(duì)照組：取 1mL 稀釋液 + 0.1mL 菌懸液，同條件培養(yǎng)；
（4）培養(yǎng)計(jì)數(shù)：細(xì)菌 30-35℃培養(yǎng) 48h，真菌 20-25℃培養(yǎng) 5-7 天，計(jì)算回收率并記錄菌落形態(tài)。
4.控制菌檢查法驗(yàn)證操作
（1）供試液制備：按樣品標(biāo)準(zhǔn)要求制成適宜濃度供試液（如 1:10）；
（2）接種培養(yǎng)：取規(guī)定量供試液 + 不大于 100CFU 試驗(yàn)菌，接入增菌培養(yǎng)基（如大腸埃希菌用膽鹽乳糖培養(yǎng)基），30-35℃培養(yǎng) 24-48h；
（3）分離鑒定：取增菌液劃線接種于選擇性培養(yǎng)基（如麥康凱瓊脂），培養(yǎng)后觀察可疑菌落，通過生化試驗(yàn)（如大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性）確認(rèn)；
（4）對(duì)照設(shè)置：同時(shí)做陽性對(duì)照（僅加試驗(yàn)菌）和陰性對(duì)照（僅加稀釋液），確保試驗(yàn)條件合規(guī)。
5.結(jié)果記錄與判定
計(jì)數(shù)法：回收率、重復(fù)性、耐用性均符合標(biāo)準(zhǔn)，且陰性對(duì)照無菌生長(zhǎng)，判定方法適用；
控制菌檢查法：陽性對(duì)照檢出目標(biāo)菌，供試品組準(zhǔn)確檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照無菌生長(zhǎng)，判定方法適用；未檢出試驗(yàn)菌需重新優(yōu)化前處理方法后驗(yàn)證。
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